Глава 8.7 - Санитарная Микробиология. Часть 2.

3. Санитарно - микробиологическое исследование воды.

Микрофлора воды.

Вода является естественной средой обитания многих микробов. Основная масса микробов поступает из почвы. Количество микробов в 1 мл воды зависит от наличия в ней питательных веществ. Чем вода сильнее загрязнена органическими остатками, тем больше в ней микробов. Наиболее частыми являются воды глубоких артезианских скважин, а также родниковые воды. Обычно они не содержат микробов. Особенно богаты микробами открытые водоёмы и реки. Наибольшее количество микробов в них находится в поверхностных слоях ( в слое 10 см от поверхности воды ) прибрежных зон. С удалением от берегов и увеличением глубины количество микробов уменьшается. В чистой воде находится 100 - 200 микробных клеток в 1 мл, а в загрязнённой - 100 - 300 тыс. и больше.

Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населённых пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3 - 4 десятка километров снова приближается к исходной величине. Это самоочищение воды зависит от ряда факторов : механическое осаждение микробных тел, уменьшение в воде питательных веществ, усваиваемых микробами, действие прямых лучей солнца, пожирание бактерий простейшими и другие.Если считать, что бактериальная клетка имеет объем 1 мк3, то при содержании их в количестве 1000 клеток в 1 мл, получится около тонны живой бактериальной массы в кубическом километре воды. Такая масса бактерий осуществляет различные приращения в круговороте веществ в водоемах и является начальным звеном в пищевой цепи питания рыб.

Патогенные микробы попадают в реки и водоемы со сточными водами. Возбудители таких кишечных инфекций, как брюшной тиф, паратифы, дизентерия, холеры и другие, могут сохраняться в воде длительное время. В этом случае вода становится источником инфекционных заболеваний. Особенно опасно попадание болезнетворных микробов в водопроводную сеть. Поэтому за состоянием водоёмов и подаваемой из них водопроводной воды установлен санитарно - бактериологический контроль.

Санитарно - микробиологический анализ питьевой воды.

Отбор пробы воды.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или ёмкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися ( силиконовыми, резиновыми или из других материалов ) пробками и защитным колпачком ( из алюминиевой фольги, плотной бумаги ). Многоразовая посуда, в том числе пробки, должны выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.Пробу отбирают в стерильные ёмкости с соблюдением правил стерильности. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в ёмкость, предназначенную для отбора проб, до стерилизации вносят натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды.

После наполнения ёмкость закрывают стерильной пробка и колпачком. Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием названием пробы, места забора, даты ( год, месяц, число, час ), цель исследования, куда направляется проба для исследования, подписью лица, взявшего пробу.

Безопасность питьевой воды по эпидемиологическим показаниям ( по СанПину 2. 1. 4. 559 - 96 ).

Хранение и транспортировка проб воды.

К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора. Доставка проб осуществляется в контейнерах - холодильниках при температуре 4 - 10 ° С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими материалами, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 часов.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 часов после забора. При несоблюдении времени доставки пробы и температуры хранения анализ проводить не следует.

Подготовка посуды к анализу.

Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть замкнуты силиконовыми или ватно - марлевыми пробками и упакованы так, чтобы исключить загрязнение после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.

Новые резиновые пробки кипятят в 2 % - м растворе натрия двууглекислого 30 минут и 5 раз промывают водопроводной водой ( кипячение и промывание повторяют дважды ). Затем пробки 30 минут кипятят в дистиллированной воде, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завёрнуты в бумагу.

Чашки Петри в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завёрнуты в бумагу. Подготовленную посуду стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160 - 170 ° С 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60 ° С.После выполнения анализа все использованные чашки и пробирки обеззараживают в автоклаве при ( 126 + - 2 ) ° С 60 минут. Пипетки обеззараживают кипячением в 2 % - м растворе NaHCO3.

После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.

Подготовка проб воды.

Прежде чем приступить к посеву, пробу необходимо тщательно перемешать и обработать горящим тампоном край ёмкости с тем, чтобы устранить его возможное загрязнение во время транспортирования. На используемых для посева пробирках и чашках необходимо обозначить номер пробы, объём воды или разбавление, дату посева. Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу необходимо перемещать стерильной пипеткой.

Определение колимформных бактерий в воде методом мембранных фильтров.

Фильтровальный аппарат отбирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата ( столик ) фламбированным пинцетом кладут стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора ( стаканом, воронкой ) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора. В верхнюю часть прибора наливают точно отмеренный объём воды, затем создают вакуум в нижней части прибора. При фильтровании 1 мл исследуемой воды или ее разбавлении в воронку предварительно следует налить не менее 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования воронку снимают, фламбированным пинцетом фильтр осторожно приподнимают край при сохранении вакуума для удаления излишка воды на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Выполнение анализа.

При исследовании воды на выходе с водопроводных сооружений и в распределительной сети необходимо анализировать 3 объёма 100 мл. Точно отмеренный объём воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением вышеуказанных требований. Фильтры помещают на среду Эндо, ставят в термостат вверх дном и инкубируют посевы при температуре ( 37 + - 1 ) ° С в течение 24 + - 2 часов.

Учёт результатов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии или выросли колонии с неровными краями и поверхностью ( пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные,слизистые ). При сливном росте на всех фильтрах проводят рассвев на среде Эндо для получения изолированных колоний обычными бактериологическими методами.При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде - темно - красных, красные с металлическим блеском и без него, а также лактозоотрицательных - розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида, делают их посев на скошенный агар и далее изучают биохимические тесты. В качестве подтверждающих используют оксидазный тест и тест образования кислоты газа при ферментации лактозы или маннита ( глюкозы ).Для определения оксидазной активности на фильтровальную бумагу надо поместить 2 - 3 капли свежеприготовленного реактива для оксидазного теста. Заранее приготовленные бумажки смачивают дистиллированной водой. Стеклянной палочкой помешают мазок свежей культуры на подготовленную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 10 - 30 секунд появляется фиолетово - коричневое или синее окрашивание.

Культуры, давшие оксидазоположительные реакции, дальнейшему исследованию не подлежат, так как к общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37 ° С в течение 24 часов.Термотолерантные колимфорные бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения и обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые кроме того способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 ° С в течение 24 часов.

Все типичные лактозоположительные колонии засевают в подтверждающие среды с лактозой и маннитом и инкубируют в течение 24 часов при температуре 37 ° С для определения общих колиформных бактерий.Для определения термотолерантных бактерий посев производят в среду, предварительно прогретую до температуры 44 ° С, и инкубируют при этой же температуре в течение 24 часов.Колонии учитывают как общие колимфорные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита ( глюкозы ) при температуре 37 ° С с образованием кислоты и газа. Среди этих колоний учитывают как термотолерантные колимфорные бактерии при оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 ° С с образованием кислоты и газа.

Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то для вычисления числа колимформных бактерий среди этих колоний используют формулу :

Где Х - число колоний одного типа ;

а - общее число колоний этого типа ;

b - число проверенных из них ;

с - число колоний с положительным результатом.

Вычисление и представление результатов.

Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц ( КОЕ ) общих колиформных бактерий в 100 мл воды. Для подсчёта результата суммируют число колоний, подтвержденных как общие колимфорные бактерии, выросших на всех фильтрах, и делят на 3.

Примеры. При посеве трех фильтров по 100 мл выросло две колонии на одном, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих колиформных бактерий будет : 2 : 3 = = 0,7 КОЕ в 100 мл.