Глава 8.8 - Санитарная Микробиология. Часть 3.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов ( ОМЧ ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 ° С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

             Выполнение анализа.

Из каждой пробы отобранной воды должен быть сделан посев не менее двух объемов по 1 мл. После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, сразу же в каждую чашку вливают 6 - 8 мл расплавленного и остужденного до 45 - 46 ° С питательного агара. Затем смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37 ° С на 24 часа.

Вычисление и представление результатов.

Должны быть подсчитаны все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчет следует производить только на тех чашках, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц ( КОЕ ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом.

Титрационный метод может быть использован :

✓ при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выделения анализа методом мембранной фильтрации ;

✓ при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ ;

✓ в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

            Выполнение анализа.

При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл ( анализ качественный ). При исследованиях воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий и при повторном анализе производят  посев : 3 объемов по 100 мл, 3 объёмов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл. Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо - пептонную среду. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в  10 и 1 мл концентрированной лактозо - пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при температуре 37 °  С в течение 24 - 48 часов. После 24 часов инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из ёмкостей, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев на сектора типичных для лактозоположительных бактерий колоний, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий.

         Вычисление результатов.

При исследовании трех объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно, и при обнаружении общих или термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трёх объемов делают запись в протоколе " обнаружены " в 100 мл.

При исследовании количественным методом, после определения положительных и отрицательных результатов на наличие общих и термотолерантных колиформных бактерий  в объёмах воды, посеянных в среду накопления, вычисляют наиболее вероятное число бактерий  в 100 мл пробы ( таблица ).

Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды.    

Определение колифагов прямым методом.

            Проведение анализа.

Накануне проведения анализа необходимо сделать посев Е. соli на косяк с питательным агаром. Перед проведением анализа сделать смыв бактерий с этого косяка 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь Е. соli в концентрации 10 бактериальных клеток в 1 мл.

Расплавить и остудить до 45 ° С 2 % - й питательный агар. Исследуемую воду ( 100 мл ) внести в 5 стерильных чашек Петри по 20 мл в каждую. В питательный агар добавить смыв Е. соli из расчета 1,5 мл смыва бактерий на 150 мл агара и осторожно перемешать. Полученной смесью по 30 мл залить сначала пустую чашку Петри ( контроль газона Е. соli ), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек осторожно перемешать. Чашки оставить при комнатной температуре для застывания, а затем вверх дном поместить в термостат для инкубирования при температуре 37 ° С.

                  Учёт результатов.

Учёт результатов  проводят путем подсчёта и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах ( БОЕ ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки колифагов должны отсутствовать.

Для проведения текущего контроля качества питьевой воды используют метод определения колифагов.

Колифаги - это бактериальные вирусы, способные лидировать Е. соli и формировать при температуре 37 +- 1 ° С через 18 +- 2 г зоны лизиса бактериального газона ( бляшки ) на питательном агаре.

Исследуемую пробу воды ( 100 мл ) и чашку Петри с контролем Е. соli помещают в термостат на 18 - 20 часов при температуре 37 +- 1 ° С.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. соli ( или 0,2 мл 4 - часовой бульонной культуры ) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. После инкубации из исследуемой пробы воды в пробирку отливают 10  мл и добавляют 1 мл хлороформа. Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре не менее 15 минут до полного осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и осужденный до 45 - 49 ° С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактрий Е. соli из расчета 1,0 мл смыва на 100 мл агара. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы и заливают смесью расплавленного и обстуженного до 45 - 49 ° С питательного агара объёмом 12 - 15 мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. соli, перемешивают и оставляют на столе до полного застывания агара, затем чашки Петри ставят в термостат на 18 +- 2 часа при 37 ° С.

                    Учёт результатов.

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. При наличии зон лизиса в контроле  - результат считается недействительным.

                Практическая часть.

1. Произвести отбор пробы воды из крана по всем правилам для бактериологического исследования.

2. Произвести посевы из каждой отобранной пробы по 1 мл воды в стерильные чашки Петри с расплавленным питательным агаром для определения общего числа микробов.

3. Произвести подсчет выросших на чашках ( заранее подготовленных ) колоний и выразить результат в колоний - образующих единицах ( КОЕ ).

4. Составить схемы санитарно - бактериологического исследования воды фильтрационными и титрационным методами.

Глава 8.9 - Микрофлора почвы.

Почва - это смесь частиц органических и неорганических веществ, воды и воздуха.

Неорганические частицы почвы - это минеральные вещества, окружённые плёнкой коллоидных веществ органической или неорганической природы.

Органические частицы почвы - это остатки растительных и животных организмов, то есть гумус. Почва обильно заселена  микроорганизмами, так как в ней есть все необходимое для жизни : органические вещества, влага, защита от солнечных лучей.

В почве встречаются все формы микроорганизмов, которые есть на Земле : бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие, растения. Общее  микробное число в 1 г почве может достигать 1 - 5 млрд. В 1 га почвы содержится 1 тонна живого веса бактерий, однако в разных слоях колличество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое почвы микроорганизмов очень мало ( слой примерно 0,5 см ). На глубине 1 - 2 - 5 см до 30 - 40 см число микроорганизмов больше всего. В этом слое ОМЧ в среднем 10 - 50 млн в 1 г. В относительно чистых почвах этот показатель равен 1,5  - 2 млн в 1 г. Глубже  30 - 40 см число микроорганизмов снижается и в более глубоких слоях их опять мало.