Глава 8.6 - Санитарная Микробиология.

Санитарно - микробиологические исследования.

1. Значение санитарной микробиологии и ее задачи.

Микроорганизмы, и в первую очередь бактерии, распространены в природе гораздо шире, чем другие живые существа. Благодаря исключительному разнообразию усвоения питательных веществ, малым размерам и лёгкой приспособляемости к различным внешним условиям бактерии могут быть обнаружены там, где отсутствуют другие формы жизни.

Сложные взаимоотношения микроорганизмов со средой, которые обуславливают их размножение, развитие и выживание, изучает специальная биологическая наука - экология.

Но существует и медицинская наука - санитарная микробиология, которая также занимается изучением микроорганизмов и процессов, вызываемых ими в окружающей среде. Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, то есть осуществление постоянного контроля за водой, воздухом, почвой, пищевыми продуктами и так далее с целью выявления патогенных микроорганизмов, либо выявление санитарно - показательных микроорганизмов, которые являются косвенными показателями зараженности окружающей среды.

Санитарно - показательные микроорганизмы - это постоянные обитатели поверхностей и полостей тела человека и животных, выделяющихся из организма теми же путями, что и патогенные. Поэтому, чем больше выявлено санитарно - показательных микроорганизмов, тем большая вероятность попадания в объекты внешней среды патогенных микроорганизмов.

Для каждого объекта внешней среды имеются определённые санитарно - показательные микроорганизмы - критерии оценки по бактериологическим показателям. Например, в отношении кишечных инфекции роль таких индикаторов принадлежит кишечным палочкам - постоянным обитателям кишечника человека и животных.

Санитарно - бактериологические исследования проводятся в строгом соответствии со специальными государственными общесоюзными стандартами, приказами, методическими рекомендациями, правилами, которые позволяют дать оценку соответствия выявленной в окружающей среде микрофлоры гигиеническим требованиям. В нормативных документах отражены правила отбора проб, количество материала, условия транспортировки, методы и цель исследования, а также критерии оценки полученных результатов.

Распространение микроорганизмов в природе, роль в круговороте веществ.

Все живое на Земле, происходящее когда-то из неживой материи и качественно отличающееся от последней, находится в теснейшей связи с мёртвой природой. Существует постоянное равновесие и взаимосвязь между живой и неживой природой, происходит беспрерывная цепь превращений вещества и энергии на земной поверхности, беспрерывный процесс созидания и разложения органического вещества.

Этот непрерывный процесс составляет малый биологический круговорот, составляющий часть большого, абиогенного ( безжизненного ) круговорота, который изучается геохимией и геологией.В биологический круговорот вовлечены атомы всех химических элементов, составляющих живое вещество. Из них особенно важно рассмотреть круговорот углерода, азота, серы и фосфора.

Зелёные растения и автотрофные микроорганизмы строят органические соединения своего тела, пользуясь только минеральными формами углерода ( углекислота атмосферы ) и минеральными формами азота ( аммиачные и азотно - кислые соли ). Они осуществляют первичный синтез органических веществ на Земле из простых неорганических соединений.

Единственным источником углеродного питания для зелёных растений является углекислота. Зелёные растения благодаря солнечной энергии превращают углекислоту, не имеющую никакой энергетической ценности, в углеводы, белки и жиры, имеющие исключительную энергетическую ценность. Всё земное царство является огромным аккумулятором солнечной энергии, которую оно переводит в скрытую энергию своих сложных органических соединений.Посчитано, что зелёное растения ежегодно извлекают из атмосферы 1/50 часть всего количества углекислоты атмосферы. Следовательно, лет через 50 вся углекислота могла бы быть переведена в органические соединения растительных и животных организмов. Исчезновение углекислоты сделало бы невозможной жизнь растений, а следовательно, и животных на Земле. Но в действительности этого не наблюдается. Общеизвестно, что содержание углекислоты в атмосфере постоянно и равняется 0,03%. Это постоянство обуславливается тем, что в природе одновременно происходят и обратные процессы - обогащения атмосферы углекислотой. Одновременно с синтезом органического вещества в природе идёт разложение органического вещества до неорганических соединений,таких как CО2, Н2О, NH3, H2S и другие.

То же самое можно сказать и в отношении азота. Растения не могут усваивать свободный азот из атмосферы и азот, связанный в органических соединениях. Они усваивают только минерализованные азотные соединения - аммонийные и азотнокислые соли. В пахотном слое 1 га почвы содержится 600 кг азота, но усвояемые формы для растений составляют только 1%. Такое количество усвояемого азота не обеспечило бы и одного хорошего урожая.Таким образом, жизнь на Земле возможна только при непрерывном разложении органического вещества, синтезированного растениями и животными. Эта грандиозная переработка всех отмерших остатков растительного и животного царства осуществляется микроорганизмами. В ходе своей жизнедеятельности они происходят минерализацию органических веществ - белков, жиров, углеводов - с образованием в конечном итоге углекислоты, воды, аммиака, нитратов, неорганических соединений серы и фосфора, усвояемых растениями. Эти вещества вовлекаются в новых круговорот. Чем энергичнее протекают процессы разложения органических веществ, тем больше развивается органическая жизни, быстрее осуществляется круговорот веществ в природе.Такая колоссальная работа микроорганизмов обуславливается их чрезвычайно широким распространением в природе, чрезвычайной быстротой размножения, разнообразием типов их питания и ферментных систем.

2. Микрофлора воздуха.

Микрофлора воздуха зависит от микрофлоры воды и почвы, над которыми расположены слои воздуха. В почве и воде микробы могут размножаться, в воздухе они не размножаются, а только некоторое время сохраняются. Поднятые в воздух с пылью, они либо оседают с каплями обратно на поверхность земли, либо погибают в воздухе от недостатка питания и от действия ультрафиолетовых лучей. Однако некоторые из них более устойчивые, например, туберкулёзная палочка, споры клостридий, грибов и другие, могут длительно сохраняться в воздухе.Наибольшее количество микробов содержится в воздухе промышленных городов. Наиболее чист воздух над лесами, горами, снежными просторами. Верхние слои воздуха содержат меньше микробов. Над Москвой на высоте 500 м в одном метре воздуха содержатся 2 - 3 бактерии, на высоте 1000 м - в 2 раза меньше. Весьма богат микробами воздух в закрытых помещениях, особенно в лечебно - профилактических, детских дошкольных учреждениях, школах и так далее. Вместе с безвредными сапрофитами в воздухе зачастую находятся болезнетворные микробы.При кашле, чихании в воздух выбрасывается мельчайшие капельки - аэрозоли, содержащие возбудителей заболеваний, таких как грипп, корь, коклюш, туберкулёз и ряд других, передающихся воздушно-капельным путем от больного человека - здоровому, вызывая заболевание.

Санитарно - бактериологическое исследование воздуха.

Скопление и циркуляция возбудителей заболеваний в воздухе лечебно-профилактических учреждений является одной из причин возникновения госпитальных гнойно-септических инфекций, которые наносят колоссальный экономический ущерб, увеличивая стоимость лечения в 2 раза.Вследствие этого в последнее время уделяют большое внимание санитарно - бактериологическому исследованию воздуха в больницах, операционных, родильных домах, детских учреждениях и другие. Исследования проводят как и в плановом порядке, так и по эпидемиологическим показаниям. Бактериологическое исследование воздушной среды предусматривает :

- определение общего содержания микробов в 1 м3 воздуха ;

- определение содержания золотого стафилококка в 1 м3 воздуха.

Отбор проб воздуха для бактериального исследования проводят в следующих помещениях :

* Операционных блоках ;

* Перевязочных ;

* Послеоперационных палатах ;

* Родильных залах ;

* Палатах для новорожденных ;

* Палатах для недоношенных детей ;

* Послеродовых палатах ;

* Отделениях и палатах интенсивной терапии и других помещениях, требующих асептических условий.

Методы отбора проб воздуха.

Существуют два основных способа отбора проб воздуха для исследования :

1. Седиментационный - основан на механическом оседании микроорганизмов ;

2. Аспирационный - основан на активном просасывании воздуха ( этот метод дает возможность определить не только качественное, но и количественное содержание бактерий ).

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппарата Кротова, который состоит из трёх основных частей : основания, корпуса и крышки. В крышке укреплен диск из прозрачного органического стекла с клиновидной щелью для засасывания воздуха. Для определения количества воздуха, прошедшего через прибор, на наружной стенке корпуса помещён ротаметр. В верхней части корпуса расположен вращающийся диск, на который устанавливается чашки Петри. Засасывание воздуха в прибор осуществляется центробежным вентилятором, насаженным на ось электродвигателя. Поступающая в прибор струя воздуха ударяется о поверхность находящийся в чашке питательной среды, оставляя на ней микроорганизмы, и, обтекая электродвигатель, выходит через ротаметр наружу.

Скорость протягивания воздуха составляет 25 л в минуту. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 литров для определения общего содержания бактерий и 250 литров для определения наличия золотого стафилококка.При отборе проб в разных помещениях необходимо обрабатывать поверхность аппарата, столик, внутренние стенки дезинфицирующим раствором 70 ° спиртом.

Определение микробного числа, патогенных микроорганизмов.

Для определения общего содержания бактерий в 1 м3 воздуха забор проб проводят на 2% питательный агар. Посевы инкубируют при температуре 37 ° С в течение 24 часов, затем оставляют на 24 часа при комнатной температуре, подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчёт на 1 м3 воздуха. Если на чашках питательного агара выросли колоний плесневых грибов, их подсчитывают и делают перерасчёт на 1 м3 воздуха. В протоколе количество плесневых грибов указывают отдельно.

Расчет. Например, за 10 минут пропущено 125 литров воздуха, на поверхности выросло 100 колоний.



Для определения наличия золотого стафилококка забор проб проводят на желточно - солевой агар ( ЖСА ). Чашки помещают в термостат при температуре 37 ° С на 24 часа и выдерживают ещё 24 часа при комнатной температуре, можно на 48 часов при температуре 37 ° С. Колонии, подозрительные на стафилококк, подлежат обязательной микроскопии и дальнейшей идентификации.

С желточно - солевой агар снимают в первую очередь колонии стафилококков, которые образуют радужный венчик вокруг колонии ( положительная лецитовителлазная реакция ). Дальнейшему изучению подвергают также пигментированные колонии и с отрицательной лецитовителлазной реакцией не менее двух колоний различного вида. Подозрительные колонии пересевают на чашки с кровяным или молочным агаром. Дальнейшее изучение их проводят по схеме.

Бактериологическое исследование на стафилококк.

1 - й день.

Посев на элективные среды ( желточно - солевой, молочно - солевой или молочно - желточно - солевой агар ). Засеянные среды выдерживают в термостате при 37 ° С в течение 2 суток, либо одни сутки в термостате и дополнительно 24 часа на свету при комнатной температуре.

2 - 3 - й день.

Просмотр чашек, фиксация в журнале характерна и массивности роста. На вышеуказанных средах стафилококк растёт в виде круглых блестящих, мастянистых, выпуклых пигментированных колоний. На средах, содержащих желток, золотистый стафилококк, выделенный от человека, в 60 - 70% случаев образует радужный венчик вокруг колоний ( положительная лецитовителлазная реакция ).Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колоний, дающие положительную лецитовителлазную реакцию.Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 ° С на 18 - 20 часов.

4 - й день.

После суточный инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства ( окраска по Грамму ) и наличие плазмокоагулирующей активности и хлопьеобразующего фактора.

Под микроскопом окрашенные по Грамму стафилококки имеют вид фиолетово - синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками ( " кружево " ).

Плазмокоагулирующую активность проверяют в реакции коагуляции плазмы ( РКП ). С учётом результатов ркплецитовителлазной активности в 70 - 75% случаев, на четвёртый день исследования может быть подтверждена принадлежность выделенного штамма к виду золотистого стафилококка и выдан соответствующий ответ.

Есть культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение других признаков патогенности - ферментация маннита в аноэробных условиях или ДНКазной активности.

Определение антибиотикограммы проводят только после выделения чистой культуры. Выделенные культуры золотистого стафилококка подлежат фаготипированию.

5 - й день.

Учёт результатов фаготипирования, определения чувствительности к антибиотикам, ДНКазной активности. Окончательная выдача ответа.

Исследование воздуха седиментационным методом допускается в исключительных случаях.

Чашки Петри с питательной средой ( МПА ) устанавливают в открытом виде горизонтально, на разном уровне от пола. Метод основан на механическом оседании бактерий на поверхность агара в чашках Петри. Чашки со средой экспонируют от 10 до 20 минут, в зависимости от предлагаемого загрязнёния воздуха. Для выявления патогенной флоры используют элективные среды. Экспозиция в этих случаях удлиняется до 2 - 3 часов. После экспозиции чашки закрывают, доставляют в лабораторию и ставят в термостат на 24 часа при температуре 37 ° С. На следующий день изучают выросшие колонии.

Критерии оценки микробной обсемененности воздуха в хирургических и акушерских стационарах.





                Практическая часть.

1. Произнести отбор пробы воздуха в учебной комнате седиментационным способом.

2. Произвести отбор пробы воздуха в учебной комнате аспирационным способом ( аппаратом Кротова ).

3. Определить общее микробное число в 1 м3 в воздуха ( использовать заранее подготовленные чашки с выросшими колониями ).

4. Изучить тинкториальные и ферментативные свойства выросших колоний.

5. Решить задачу : за 10 минут было пропущено 250 литров воздуха.  Выросло 150 колоний. Рассчитайте количество колоний в 1 м3 воздуха.