Глава 9.2 - Санитарная Микробиология. Часть 6

Отбор, направление и подготовка проб для лабораторного исследования.

Отбор проб для бактериологического исследования следует производить в стерильные широкогорлые банки, закрываемые пергаментной бумагой и обязанные бечевкой. Остатки консервов направляются на исследование непосредственно в той банке, из которой они использовались в пищу.

Мясо берут для анализа в количестве 500 г, при этом пробу отбирают из различных мест туши с обязательным взятием мезентериальных лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости.

Мелкую рыбу отбирают в количестве 2 - 3 штук, от крупной рыбы - 2 - 3 куска, в том числе и спинки, ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия.

Солёные продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середине и со дна бочки. В отдельную посуду набирают 100 - 200 мл рассола.

Пробы жидких, полужидких объектов ( супы, соусы, кремы, молочные продукты ) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200г.

Пробы испражнений отбирают из последней более жидкой порции, поступающей из верхних отделов кишечника. При наличии в испражнениях гноя, слизи, крови, их необходимо включить в отбираемый материал.

Рвотные массы отбирают в количестве 50 - 100 мл, промывные воды - 100 - 200 мл, до применения каких-либо лекарственных средств.

Кровь у заболевших забирают в стерильную сухую пробирку в количестве 8 - 10 мл.

Пробу мочи на исследование берут в количестве 20 - 30 мл. Желчь и содержимое 12 - персоной кишки берут на исследование при помощи дуоденального зонда.

Спинномозговую жидкость отбирают в стерильную пробирку в количестве 5 - 10 мл.

Отбор проб воды производят в количестве не менее 1,5 литров.

Пробы секционного материала забирают в количестве 50 - 60 г каждого органа или ткани.

В лабораторию пробы доставляют в опечатанном виде. В сопроводительном документе к материалам от заболевших ( умершего ) указывается : ФИО, возраст, адрес, место работы, должность дата заболевания, дата и время сбора материала, фамилия и должность лица, направившего материал.

Доставленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления, производится немедленно по их получении.

Исследование материалов от пострадавших :

✓ кровь засевают в питательную среду ( Раппопорт или желчный бульон ) в соответствии 1 : 10 ( 5 мл на 45 мл среды ). Термостатируют 10 дней при 37 ° С, делая высев на среду Эндо через 18 - 24 часа, на 3, 4, 6, 10 - е сутки. При наличии роста работают по общепринятой методике.

Желчь засевают в количестве 5 мл на 45 - 50 мясопептонного бульона ( 1 : 10 ), помещают на 7 суток в термостат при 37 ° С и делают высевы через 18 - 20 часов и 3, 5, 7 суток на среду Эндо. При наличии подозрительного роста работают по общепринятой методике.

Мочу центрифугируют, засевают остаток в 5 мл магниевой среды обычной концентрации или 10 мл мочи на 10 мл среды двойной концентрации. Через 18 - 20 часов инкубации при 37 ° С делают высев или петлей на висмут - сульфит агар, инкубируют при 37 ° С 48 часов. При наличии подозрительного роста идентификацию проводят по общепринятой методике.

Промывные воды желудка после нейтрализации ( 1 мл 10 % соды на 10 мл пробы ) засевают по 0,1 мл на среду Эндо ( Левина ), Плоскирева, ЖСА, кровяной агар. Дальнейшее исследование проводят в зависимости от характера роста по общепринятой методике.

Критерии диагностики

Высокая обсемененность пищевых продуктов, вызвавших отравление, 10 и более КОЕ ( колониеобразующих единиц ) в 1 г, обнаружение идентичных культур в клиническом материале от пострадавших, нарастание титра антентел при исследовании в динамике парных сывороток подтверждают диагноз пищевой токсикоинфекции.

Объекты санитарно - бактериологического обследования :

а) готовые блюда, кулинарные изделия, скоропортящиеся продукты в предприятиях общественного питания и торговли ;

б) в отдельных случаях сырье и полуфабрикаты ( по ходу технологического процесса - по эпидпоказаниям, при высокой бактериальной обсемененности готовых продуктов, блюд и другие ).

в) оборудование, инвентарь, посуда и другие с целью эффективности санитарной обработки ;

г) смывы с рук, санитарной одежды, личных полотенец ( с целью проверки соблюдения правил личной гигиены персоналом ) ;

д) вода центрального водоснабжения и особенно местных источников водоснабжения ( места водозабора и краны ).

Техника отбора проб.

Для отбора проб продуктов и блюд в лаборатории заготавливаются стерильные банки, закрытые двумя слоями бумаги и обвязанные бечёвкой, стерильные ложки, стерильные пинцеты и ножи, завёрнутые в бумагу.

Пробы продуктов рекомендуется отбирать вдвоем с привлечением в качестве помощника представителя обследуемого учреждения. Помощник в одной руке держит банку, другой - по мере необходимости открывает крышку. В это время лицо, отбирающее пробу, развертывает требующуюся ему ложку или пинцет, берет материал и переносит в банку. При необходимости отбора пробы от большого куска отрезают часть его с помощью стерильного ножа и пинцета, не менее 200 г. Жидкие блюда отбирают после тщательного перемешивания, плотные - из разных мест в глубине куска.

Глава 9.3 - Санитарно - микробиологическое исследование молока и молочных продуктов. Отбор продуктов ( ГОСТ 9225 - 84 )

Объединенную пробу молока объёмом 500 см 3 составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны. От данной пробы после тщательного перемешивания отбирают 50 - 60 см 3 продукта в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой.

От продукции, попавшей в выборку, отбирают для анализа 15 - 20 г (включая и поверхностный слой ) творога, творожных изделий, масла в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой.

При отборе сыра стерильным шпателем или ножом прижигают его поверхность. Стерильный щуп вводят наклонно в середину головки на 3/4 его длины. Из столбика сыра на щупе отбирают стерильным шпателем 15 - 20 г сыра и помещают в стерильную посуду с притёртой или ватной пробкой или стерильную чашку Петри с крышкой.Пробу, отправляемую в лабораторию, снабжают этикеткой, на которой указывают :

✓ номер пробы ;

✓ наименование предприятия - изготовителя ;

✓ наименование и сорт продукта ;

✓ номер и объем партии ;

✓ дату и час выработки продукта ;

✓ дату и час отбора проб ;

✓ должность и подпись лица, отображающего пробу ;

✓ объем необходимых анализов ;

✓ обозначение нормативно - технической документации, по которой вырабатывался продукт.

Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 часа с момента отбора проб. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала и исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6 ° С, не допуская подмораживания, а для мороженого - не выше минус 2 ° С.

Определение общего микробного числа и коли - титра в молоке.

Перед посевом готовят десятикратные разведения молока в стерильном растворе хлористого натрия. Для этого стерильной пипеткой отбирают 10 см молока и вносят в 90 см строительного раствора хлористого натрия, получают разведение 1 : 10. Далее из него готовят последующие разведения 1 : 100, 1 : 1000 и так далее.

Каждое из разделений должно быть засеяно в количестве 1 см в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10 - 15 см расплавленной и охлажденной до температуры 40 - 45 ° С питательной средой для определения количества мезофильных и факультативно - анаэробных микроорганизмов.

Содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри перевёртывают крыжками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой 30 + и - 1° С на 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке. При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на двух-трёх секторах ( но не менее чем на 1/3 поверхности чашки ), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Количество мезофильных аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов в 1см продукта ( х ) в единицах вычисляют по формуле

Х = n : 10 ( m ) ;

где n - количество колоний, подсчитанных на чашке Петри ;

m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.Допустимое количество микробов в 1 мл молока пастеризованного бутылочного 75 000, во флягах и цистернах 150 000.

Метод определения коли - титра БГКП.

Под коли - титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженные в мл ( вода, молоко, жидкие пищевые продукты ) или в г ( плотные пищевые продукты ), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек.

Метод основан на способности БГКП ( бесспоровые, грамотрицательные, аэробные и факультативно - анаэробные палочки, в основном, являющиеся представителями родов эшерихий, цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серация ) сбраживать в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при 37 ° С в течение 24 часов.

Проведение анализа.

В среду Кесслер производят посев из разведений молока от 0,1 до 0,00001. По 1 см соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см среды Кесслер. Пробирки с посевами помещают в термостат 37 ° С на 18 - 24 часа.

На вторые сутки просматривают пробирки и при отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП.

При наличии газообразования в наименьшем из засеиваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем.

Учет результатов.

Для установления коли - титра применяют стандартные таблицы.

Глава 9. 4 - Санитарно - микробиологическое исследование мяса и мясных продуктов.

Сырое мясо исследуется по требованию ветеринарной или санитарной службы на наличие различной патогенной микрофлоры : сальмонелл, возбудителей сибирской язвы и так далее. Методика исследования мяса на патогенную микрофлору изложена в ГОСТе 21237 - 75.

Полуфабрикаты из рубленого мяса исследуются также только на наличие патогенной флоры ( ГОСТ 4288 - 76 ).

В готовых кулинарных изделиях, колбасах, студнях и другие мясных продуктах, подвергнутых термической обработке, кроме того, определяются :

✓ общая бактериальная обсемененность ;

✓ обсемененность продукта микробами группы кишечной палочки и протея.

Эти показатели отражают как качество обработки продукта,так и санитарные условия его хранения.

Методика исследования кулинарных изделий из рубленого мяса ( котлеты, битки и тому подобное ) изложена в ГОСТе 4288 - 76.

Для анализа отдельно отбирают по 5 г наружной и внутренней части изделия и из каждой готовой 10% суспензию ( разведение 1 : 10 ), для чего к 5 г, помещенным в стерильную ступку, постепенно приливают 45 мл стерильного физраствора.

Для определения общей обсемененности производятся дополнительное разведение 1 : 100 ( 10% взвесь разводят в 10 раз ) и 1 мл этого разведения заливают МПА в стерильных чашках Петри. Посевы инкубируют 48 г при 37 ° С. Расчёт производят как обычно на 1 г исследуемого продукта.

ГОСТ 4288 - 76 предусматривает лишь определение наличия микробов группы кишечной палочки в 0, 5 г изделия.

Порядок анализа : 5 мл 10 % взвеси продукта засевают в 5 мл питательной среды и инкубируют посевы 24 часа при температуре 37 ° С. В случае роста кишечных палочек на среде Хейфеца, происходит ферментация манита, среда приобретает жёлтый цвет. Для окончательного заключения о наличии бактерий группы кишечной палочки в изделии делают высев с жидких сред на чашки со средой Эндо. При наличии на чашках после 24 - часовой инкубации при 37 ° С подозрительных колоний изготавливают маски и окрашивают их по Граму.

Наличие в посевах грамотрицательные неспоровых бактерий, образующих характерные для группы кишечных палочек колонии, указывает на загрязненность изделия кишечными палочками, имеющими санитарно - показательное значение.

Методы бактериологического исследования колбасных изделий и продуктов из мяса изложены в ГОСТе 9958 - 74.

Пробы для баканализа этих продуктов берут следующим образом :

а) колбасные изделия в оболочке и копчёности помещают на металлическую тарелку, тщательно протирают по поверхности тампоном, смоченным спиртом и обжигают. Затем батоны разрезают продольно ( стерильным фламбированным ) ножом или скальпелем на 2 половинки, не рассекая противоположную сторону батона. Пробу снимают путём соскоба или среза фарша с обеих половинок всей поверхности разрезанного батона ;

б) из продуктов на костях стерильным инструментом вырезают кусочки, взятые с различных участков обожжённого образца на глубине 2 - 3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости ;

в) мясные хлеба, студень и другие изделия без оболочки подвергаются исследованию, взяв пробы с поверхности и из глубины продуктов.

Для этого пробу из глубины продукта помещают в тазик, смачивают спиртом и обжигают. Обожжённую поверхность соскабливают стерильным ножом или срезают и затем вырезают в нескольких местах 2 - 3 кусочка. Отобранную пробу взвешивают. 20 г помещают в ступку, и добавляя стерильный физраствор, готовят разведение 1 : 5. Для более тщательного растирания добавляют небольшое количество стерильного песка или стерильного битого стекла.

Определение общей обсемененности по ГОСТу следует производить путем посева 0,5 мл в разведении 1 : 5 и 1 : 50 в расплавленный и остуженный, как обычно, агар и чашки с посевами в термостат на 48 часов при 37 ° С.

Подсчитанное число колоний умножают на степень разведения продукта ( на 10 или 100 ), то есть определяют количество микробов в 1 г продукта.

В колбасах предусмотрено определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта, для чего 5 мл анализируемой взвеси ( разведение 1 : 5 ) вносят в пробирки, содержащие по 10 мл среды Кесслера и Хейфеца двойной концентрации - 43 ° С - 20 часов. Дальнейшее ведение исследования алогично исследованию кулинарных продуктов из рубленого мяса. По ГОСТу, если в 1,0 г продукта не обнаружены кишечные палочки, его бактериологическое состояние удовлетворительное.

Глава 9.4 ( 1 ) - Исследование консервов.

Бактериологическое исследование готовых консервов проводится по ГОСТ 30425 - 97. Консервы. Метод определения промышленной стерильности, ГОСТ 10444.15 - 94. Пищевые продукты. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов.

Анализ готовой продукции проводится лабораториями центров Госсанэпиднадзора, как правило, с целью установления промышленной стерильности консервов.

По эпидемиологическим показаниям консервы исследуют для выявления патогенной и токсигенной микрофлоры. Кроме того, консервы исследуют для выяснения причин возникновения порчи ( выявление возбудителей порчи ).

Консервированные продукты, удовлетворяющие требованиям промышленной стерильности, не должны представлять опасность для здоровья потребителя и не должны портиться во время хранения.

Готовые консервы не должны содержать патогенных микробов и иметь признаков порчи, обусловленных жизнедеятельностью микробов.

Отбор проб для исследования ( ГОСТ 26668 - 85 )

Проводят внешний осмотр банок. Отмечают наличие ржавчины, деформации, подтёков. В журнале записывают маркировку жестяных банок, со стеклянных банок отклеивают этикетку. Тщательно моют банки тёплой водой с мылом, насухо обтирают.

Проверяют герметичность банок. Для этого в эксикатор наливают свежеприготовленную в течение 15 секунд и охлаждённую до 40 - 45 ° С воду, опускают на дно эксикатора банки и наблюдают за пузырьками воздуха. Негерметичной считается банка, у которой из одного и того же места выходит стройка воздуха или периодически несколько пузырьков.

Негерметичные банки бактериологическому исследованию не подлежат. Герметически упакованные, бездефектные по внешнему виду консервы подвергаются термостатной выдержке до 10 дней при 30 - 55 ° С в зависимости от консервов для проверки на бомбаж. О наличии бомбажа судят по вздутию дна или крышки банки. Вскрытие банки и посев консервов производят при строгом соблюдении правил асептики ( в боксах ).

Исследование консервов на аэробные и анаэробы.

Проведение анализа.

В подозрительных консервах при наличии кольца на границе продукта с тарой или осадка на дне банки навески отбирают без предварительного перемешивания продукта для того, чтобы в навеску попала часть осадка или кольца. Масса или объём навески продукта должны составлять для высева в две пробирки с жидкой питательной средой - 2г или 2 см при выявлении аэробных, факультативно - анаэробных и анаэробных микроорганизмов.

После отбора навесок продукта консервы сохраняют до окончания анализа и оформления результатов при температуре 4 + - 2 ° С в условиях, исключающих их повторное заражение микроорганизмами. Если в посевах будут выявлены жизнеспособные микроорганизмы, то при необходимости отбирают дополнительные навески продукта для высева в питательные среды с целью количественного подсчёта обнаруженных микроорганизмов.

Для выявления жизнеспособных мезофильных анаэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов ( ГОСТ 10444.3 - 85 ) в каждую из двух пробирок, содержащих по 5 - 6 см жидкой питательной среды ( мясо - пептонный бульон ), вносят по 1 г или 1 см консервированного продукта. Сразу после посева на поверхность жидкой питательной среды наслаивают вазелиновое масло или парафиновую смесь слоем около 2 см.

Посевы термостатируют при температуре 30 + - 1 ° С не менее 5 суток с ежедневным наблюдением за появлением признаков развития микроорганизмов : помутнение среды, образование плёнки, газа, осадка.По мере необходимости из посевов отбирают культуральную жидкость для проведения исследований.

Принадлежность к термофильным аэробным и факультативно - анаэробным микроорганизмам устанавливают по изменению цвета среды, если она содержит индикатор бромкрезоловый популярный, морфологии клеток, наличию спор, отношению к окраске по Граму, каталазной активности.

Схема проведения анализа консервов на промышленную стерильность ( ГОСТ 30425 - 97 ).